Darnley chào đời vào năm 1545, tại Đền Newsam, Leeds, thuộc West Riding of Yorkshire, Anh quốc. Thông qua cha mẹ mình, ông tuyên bố chủ quyền bối với cả ngai vàng của Scotland và Anh, bởi vì ông là hậu duệ nhà vua James II của Scotland và Henry VII của Anh.

Cha của Darnley, Bá tước Matthew xứ Lennox, đã bị kết tội phản quốc tại Scotland bởi vai trò của ông trong cuộc chiến tranh Rough Wooing, nơi mà ông đứng về phía người Anh và chống lại thái hậu Mary của Guise và Nhiếp chính Arran, và quốc tịch Scotland của ông bị bãi bỏ năm 1545.[2] Lennox sống lưu vong ở Anh 22 năm, và trở về Scotland năm 1564. Mẫu thân của Darnley, Margaret Douglas đã rời khỏi Scotland năm 1528.[3]

Lord Darnley từ nhỏ được giáo dục tốt và ý thức được về hoàn cảnh hiện tại cũng như những cơ hội đến với ngai vàng của mình. Ông thông thạo tiếng Latinh và khi lớn lên đã học tiếng Gaelic, Anh và Pháp. Ông có năng khiếu về ca hát, khiêu vũ và chơi đàn. Gia sư của ông bao gồm học giả người Scotland, John Elder, người đã từng ủng hộ việc thiết lập liên minh cá nhân Anglo-Scotland bằng cuộc hôn nhân giữa Mary Stuart với Hoàng tử Edward nước Anh, và ông từng nêu ý kiến của mình với Henry VIII bằng Lời khuyên của một Redshank năm 1543..[4] Một trong những bạn học của ông, Arthur Lallart, bị thẩm vấn tại London sau chuyến thăm tới Scotland năm 1562.[5]

Darnley khỏe mạnh và giỏi thể thao, một tay cưỡi ngựa cừ khôi với kiến thức với vũ khí và niềm đam mê săn bắn. Darnley đã viết một bức thư cho Mary I của Anh từ Đền Newsam vào tháng 3 năm 1554 đề cập đến một vở kịch hay bản đồ mà ông tạo ra, mang tên Utopia Nova. Ông mong muốn, "mỗi sợi tóc trên đầu tôi sẽ được dùng cho một wourthy souldiour".[6]